“实用精子图”- 根据 WHO 的射精诊断

精子图 – 不仅仅是实验室预约

精液质量受内分泌和外部影响，必须加以认识，必要时进行治疗。定期服药会影响荷尔蒙控制轴（下丘脑-垂体-性腺轴）。这包括男性性腺功能减退症中的睾酮替代。由此产生的促性腺激素抑制导致可逆的少精子症或无精子症。因此，对于希望生育的患者，睾酮治疗是禁忌的。精子发生恢复大约需要 3 到 9 个月。滥用合成代谢类固醇（例如在休闲运动中或被健美运动员滥用）会导致类似的效果[ 12、13 ]。抗组胺药，H 2-受体阻滞剂或抗抑郁药也会破坏垂体轴和性腺功能。必要的药物会对精子细胞的形成产生不同的影响，从而影响射精质量，因此必须包括在评估中。急性发热感染可暂时损害精子发生并导致精液质量下降，通常在 3 至 6 个月后恢复正常。此外，影响性禁欲期种子质量。因此，建议在射精诊断前等待 2 至 7 天，并记录与此的偏差。少于 48 小时的短暂禁欲会导致精子数量减少，超过 7 天的长时间禁欲会导致精子数量减少，例如。B.降低精子的活力[ 1 ]。

根据 WHO 2010 的射精分析 – “逐步”

射精由 2 种主要成分组成：较小部分（约 5%）来自睾丸，主要由精子组成，较大部分（约 95%）是精浆，是附睾液和精液的混合物附属性腺（前列腺和精囊）[ 14 ]。

精子数量、活力和形态是评估射精的 3 大基石，并根据 Rili-BÄK 进行内部和外部质量控制。

除了等待期（2 至 7 天）外，WHO 标准精液分析还记录了射精量和 pH 值、精子活力、圆形细胞和白细胞以及精子自身抗体。任选地，可以将精浆标记物α-葡萄糖苷酶、果糖和锌的分析添加到梗阻的鉴别诊断中。在自然受精中，精浆的这些成分是精子进入女性生殖道所必需的。在人工授精中，一些分子，如 B. 锌或前列腺素，有害，因此应尽可能在射精后 1 小时内与精子分离（见下文；[ 15 ]）。

精子的评估基于 400 倍放大的显微分析和双倍值测定，如果可能的话，在经过足够的时间将精液液化 30 到最多射精后 60 分钟。在检查了允许的偏差之后，平均值被形成为两个结果的最终结果。允许的偏差以表格和图形的形式存储在 WHO 手册中 [ 1 ]。表 1总结了目前评估射精的有效参数，并根据手稿撰写时刚刚在线发布的 WHO 精子图的更新数据，对可能的修改进行了展望（[ 2 ]，有待进一步调整）。此更新基于 2010 年至 2020 年间发表的原始文章中 1789 名男性的精子图数据，并结合了 2010 年 [ 8 ] [ 2 ] 的数据。由此产生的 WHO 手册第 6 版包括一个数据库，其中包含来自 5 大洲的 3589 名 TTP 为 12 个月或更短且禁欲期为 2 至 7 天的男性 [ 2 ]。

精液分析顺序中的实际工作步骤如下所示。进一步的细节在实验室手册中有描述。（修订后的较低参考值 [ 2 ]分别添加在方括号中。）

步骤 I包括在室温下或在 37 °C 的培养箱中孵育样品 30（最多 60）分钟后，精液收集（最好在诊所/诊所的合适房间）进行液化。如果液化是在室温下完成的，那么显微工作也是在室温下完成的。如果在培养箱中进行液化，则还使用 37°C 的热板显微镜在 37°C 下进行显微镜检查。

第二步包括体积、颜色、稠度的宏观检查：

体积测定从使用合适的分析天平称量精液样本开始，其中用于精液输送的“尿杯”在射精输送前后称重，差值给出射精重量，从而得出射精体积，因为重量与体积相关：1 ml 射精量 = 射精密度 1 g/ml（正好是 1.014 g/ml）。下限被认为是 1.5 毫升 [1.4 毫升] 射精量。在任何情况下都不应将样品转移到量筒或用移液管吸取，因为粘度会导致高达 15% 的体积损失。确定体积具有重要意义，因为精液样本中精子总数的确定取决于该值，这可能决定进一步的治疗。

射精的颜色是灰色乳白色且均匀，褐色变色表明血液混合物，透明度增加表明精子浓度较低。

用玻璃棒评估稠度- 如果粘液线长于 2 厘米，则稠度会增加。还应注意凝固。这些方面使正确的射精分析变得复杂。

第三步：紧接着用试纸测定pH值，7.2以上为正常。如果样品长时间未处理，pH 值也会发生变化。

第四步包括对精液进行完整的显微镜检查。运动性和活力分析是首要参数，因为它们在液化后变化最快。

用于运动测定将 10 µl 混合均匀的精液移至 2 张载玻片上（重复测定！）并盖上 22 × 22 mm 的盖玻片。体积和盖玻片大小之间的关系是由于载玻片和盖玻片之间需要深度，以允许精子进行不受限制的旋转运动。允许制剂短暂休息（沉降），然后对 200 个精子计数两次，根据标准进行评估：渐进运动（PR）、非渐进运动（NP）和不动（IM）。在前向运动中，精子快速向前移动 (25 µm/s) 或缓慢向前移动，空间明显增加（下限：≥32% [≥30%]）。NP精子“原地”移动或在没有获得空间的情况下以小圆圈移动，

紧接着，进行伊红测试以确定活力：将 5 µl 曙红和 5 µl 射精分别在载玻片上混合，然后再次将盖玻片 (22 × 22 mm) 放在上面。曙红与精液一起孵育 ≥ 30 秒，最好是 2 分钟。由于只有死精子的细胞膜受损，它们才能让红色染料渗透。此处也对 200 个精子进行了两次分析（双重测定），并给出了染色精子与未染色精子的百分比。≥58% [≥53%] 有活力（未染色）的精子被认为是正常的。或者，也可以进行伊红-苯胺黑测试，这种测试的制作更复杂，但可以评估干燥的涂片制剂。

下一步检查精子自身抗体的存在使用 MAR（“混合抗球蛋白反应”）测试。很少观察到凝集作为射精中自身抗体的间接指示，如果注意到也应记录在案。凝集描述了通过精子头部或鞭毛相互连接的“巢状”精子，这些精子主要是不活动的。然而，精子自身抗体也可以在没有凝集的情况下存在。精子自身抗体形成的原因尚未阐明。MAR 测试用于检测针对精子的自身抗体，应根据 WHO 2010 定期进行 – 然而实际上并非如此，因为许多实验室回避这项工作。然而，该测试可以提供有关免疫性生育障碍的信息，尤其是在精子数量基本正常且未受孕的患者中。因此，可能会导致胞质内单精子注射的指征。

对于MAR 测试，需要针对人血浆蛋白的抗血清（抗 IgG [免疫球蛋白 G] 和抗 IgA），以及必须“清洗”的恒河猴因子阳性 0 型血红细胞。作为生产相应红细胞的替代方法，有用人 IgG 或 IgA 致敏的乳胶颗粒，如果存在自身抗体，在添加特异性抗 IgG 或抗 IgA 后，乳胶颗粒会与精子结合。结合红细胞（或乳胶颗粒）的活动精子的数量是相对于未结合的活动精子（计数 2×200 个活动精子）进行评估的。如果超过 50% 的精子被抗体结合，则该测试被认为具有临床意义，超过 10% 则被视为阳性。

随后是用于白细胞计数的过氧化物酶染色。白细胞属于圆形细胞群，可以在显微镜下在射精中看到，例如 可能包括生精细胞。白细胞（粒细胞）中过氧化物酶的检测用于分化。专门制备的溶液必须以 1:10（射精与工作溶液）的比例孵育 20 分钟，然后可以在 Neubauer 室中计数。过氧化物酶阳性白细胞染成棕色。

或者，如果进行了巴氏染色（或用碱性和酸性染料染色），也可以对形态学涂片进行白细胞计数。白细胞的细胞核呈蓝色，精子发生细胞（其他圆形细胞）的细胞核呈粉红色。

白细胞计数≥100 万/mL 表明存在输精管感染，建议对精液进行微生物学检测。如果培养物中的菌落形成单位 (CFU) ≥ 1000 /ml，则应进行与电阻图尽可能一致的抗菌治疗 [ 16、17 ]。

只有这样，经过适当稀释后，才能在 Neubauer 改进的计数室中测定精子浓度。推荐使用 WHO 缓冲液（WHO 稀释剂）进行稀释，它很容易由碳酸氢钠（50 g）、福尔马林（10 ml，35%）和龙胆紫溶液（≤5 ml）配制而成，并用 Aquadest 配制成 1000 ml。彻底混合过滤后，溶液即可使用；应定期过滤，并可在 4–6 °C 下无限期保存。

选定的稀释方法基于估计未稀释射精中每个视野的精子数量（表 2）。非常重要的是精液样品的良好混合和使用容积式移液器进行移液（由于精液的粘度）。将稀释的精液等分试样放入两个计数室中的每一个中。由于 Neubauer 改进的计数室有 2 个室，因此在精子在室中安顿下来后可以立即进行重复计数（2 次 200 个精子）。计数的方格数（≥5个，≤25个计数室）取决于每个方格的精子数：

<10 个精子/方格 → 计数 25 个方格；

10 到 40 个精子/方块 → 数 10 个方块；

>40 个精子/方格 → 计数 5 个方格。

然后将计数的方块数和稀释度包括在转换中以确定每毫升的精子浓度，并在考虑体积的情况下确定每次射精的精子总数。精子浓度的下限为每毫升至少 1500 万个精子 [≥1600 万/毫升]，每次射精的总数至少为 3900 万 [≥3900 万/射精]。

对于形态必须准备固定涂片制剂（用 95% 乙醇固定），准备用 WHO 推荐的染色剂（Papanicolaou、Shorr 或 DiffQuick 染色剂）进行计数。就成本效益比而言，使用 DiffQuick 进行快速染色特别适合每周进行 <20 次精子造影的实验室。将 10 µl 精液滴在载玻片边缘，并用第二张载玻片以 45° 角拉出。涂片的质量取决于样品的粘度、精子浓度、涂片角度等。因素影响。固定前，涂片应风干 ≥ 4 小时，并制作 ≥ 2（最好更多）涂片。对于使用 100 镜头（油，第 3 阶段）进行的诊断，正常和异常精子的分裂就足够了。然而，记录反复出现的缺陷（例如顶体、鞭毛）是有意义的。在这里，200 个精子在 2 个固定和染色的涂片上也被计数两次。下限被认为是 ≥ 4% 正常形成的精子。

根据 WHO 对精液质量的描述

射精诊断的结果导致对精液质量的诊断描述：当所有 3 个基本参数都在正常范围内时，就存在正常精子症：

≥3900万个精子/射精，

≥32% [30%] 前向活动精子，

≥4% 形态正常的精子。

低于总数、活力和/或形态的情况被称为少精子症、弱精子症和/或畸形精子症。

无精子症描述的是射精中没有精子，因此可以使用 3 种方法进行分析 [ 1 ]。射精 (3000 g) 离心后计数最常用于区分完全没有精子（无精子症）和存在单个（活动）精子（隐精子症） ，原则上仍可用于受精治疗。

为了区分梗阻（梗阻性无精子症，OA）和睾丸原因导致的无精子症（非梗阻性无精子症，NOA），除了临床参数（卵泡刺激素 [FSH]、睾丸体积）。在这里，特别是对 α-葡萄糖苷酶的分析已被证明是有价值的。

精子处理方法

已经建立了各种形式的精子处理，用于进一步的鉴别诊断以及辅助受精治疗，包括简单的清洗、上游程序或Percoll 密度梯度离心（图 1；[ 15 ]]). 为了更好地评估治疗方法的选择，所谓的样品制备（样品上游）可以提供有关精子质量的信息，作为诊断的一部分。还可以记录精子的 24 小时存活率（“24 小时存活率”）——这是在生殖道中存活能力的重要临床指标。由于死亡率很高，这可能是乍一看精液水平正常但无法怀孕的可能原因。此外，事实证明，使用计算机辅助精子分析(CASA)对运动特性进行的额外分析对于评估精子前向运动能力非常有用。可以作为一个相关参数计算出来，以便更好地估计所需的精子数量和成功的机会，特别是在宫腔内授精 (IUI) 或体外受精 (IVF) 方面。

图。1

根据世界卫生组织 (WHO) 的精子处理方法：a 简单清洗，b 上游，c 密度梯度。（来自 [ 15 ]）

顺便说一下，CASA 仍然被认为主要是实验性的，不幸的是，到目前为止，它对常规诊断的影响很小。居家自测反复出现在媒体和开发中，但尚未得到充分验证或确立。人工智能领域正在研究适当的应用，临床应用的进一步发展还有待观察。

精子功能测试

除了描述性精子诊断之外，为了更深入地了解精子功能，开发和使用了可以提供有关精子功能详细信息的测试。

激光辅助精子选择

激光辅助精子选择 (LASS)作为 ICSI（胞浆内单精子注射）治疗的一部分而建立，主要使用不动的睾丸精子和主要不动的射精精子，激光辅助精子选择 (LASS) 已成为常规，以区分死活精子和活死精子 [ 18 ]。激光的使用不会改变精子，也不会使其暴露于任何潜在的有毒物质。只要证明其具有活力，它就可以在对鞭毛进行激光测试后用于 ICSI，没有任何不利影响。这提高了受精率 [ 19 ]。或者，HOS（“低渗肿胀”）测试（添加低渗溶液）或药理学诱导的精子尾部运动（茶碱、己氧可茶碱）被作为活力测试进行讨论 [ 19 ]。

精子 DNA 的完整性会影响受精和怀孕或流产的风险。有多种测试方法可用于 DNA 片段化分析，所有这些方法迄今为止仅在非常有限的范围内得到验证（SCSA [“精子染色质结构分析”]、TUNEL [“末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记”]、 Comet, [FCCE 这同样适用于DNA 浓缩分析（鱼精蛋白、组蛋白；[ 15 ]）。

已经采用拉曼显微光谱法进行了进一步的实验方法，拉曼显微光谱法是一种结合光谱和显微镜的方法，它使用细胞的分子指纹来表征其 DNA 完整性[ 20、21 ]。

精子离子通道的分析在受精过程中起着至关重要的作用，其分析前景广阔，即将成为临床常规应用。外源因素和遗传变化都会影响精子定位卵子并使卵子受精的能力 [ 22 ]。对不明原因夫妇不育症的主要正常精子患者进行系列测试的首次研究表明，特定的钙通道缺陷导致受精失败，无论是在体内还是在体外. 只有 ICSI 才能为这些患者提供亲子鉴定的机会，并且可以通过早期检测显着缩短这些夫妇的磨难时间。

辅助生殖医学治疗程序的选择（IUI、IVF、ICSI）

辅助生殖医学程序的选择取决于女性和男性的初步检查结果，其中精液诊断结果是一个重要但不是唯一的参数。图 2说明了决策过程的主要特征，其中还必须考虑伴侣的年龄、男性（和女性）的临床检查结果，尤其是夫妻双方对或多或少复杂程序的期望。辅助生殖的负担尤其在 IVF 和 ICSI 治疗中增加，因为复杂的内分泌卵巢刺激治疗是女性治疗的一个组成部分。这些程序基本上可以由法定和私人健康保险公司报销，这与因程序而异的框架条件有关。已婚夫妇的年龄应为女方 25 至 40 岁，男方 25 至 50 岁，这样至少 50% 的治疗费用可以报销 3 次连续的治疗尝试。根据现行指南，ICSI 治疗需要获得报销批准才能实施。先决条件是严重的男性生育障碍，根据有效的 WHO 标准，通过 2 份精子图记录，并由男科医生评估。该男子的检查应由具有“男科”附加资格的医生进行，并在 ICSI 治疗的适应症之前进行。根据现行 WHO 标准，由 2 份精子图记录，由男科医生评估。该男子的检查应由具有“男科”附加资格的医生进行，并在 ICSI 治疗的适应症之前进行。根据现行 WHO 标准，由 2 份精子图记录，由男科医生评估。该男子的检查应由具有“男科”附加资格的医生进行，并在 ICSI 治疗的适应症之前进行。

图 2

根据射精质量决定辅助生殖技术 (ART) 程序（IUI 宫腔内人工授精、IVF 体外受精、MAR “混合抗球蛋白反应”、OAT少弱畸形精子症、ICSI胞浆内单精子注射、MESA显微外科附睾精子抽吸、TESE睾丸精子提取） . （来自[ 7 ]）

如果射精或附睾或睾丸精子中存在低温贮存库，则可选择 ICSI 疗法，并且不需要进一步检测，除非精液质量随时间恢复或改善。

实践结论

射精诊断是澄清未实现生育愿望的一个组成部分，也是选择最佳治疗方案的先决条件之一。

分析根据世界卫生组织 (WHO) 的规范进行标准化，包括仔细的宏观检查（体积、颜色、稠度、pH 值）和显微镜检查（运动性、活力、MAR [“混合抗球蛋白反应”] 测试、白细胞计数、浓度和形态），这可以通过精浆和样品制备的生化标记分析来补充。

将来，精子功能测试可能能够进一步改进鉴别诊断，以提供更好、更有针对性的治疗。

根据 SGB V，对未满足生育愿望的诊断是一项服务，费用报销以及射精诊断和人工授精措施的实施均受联邦联合委员会 (GBA) 和德国联邦联合委员会 (GBA) 和德国医学协会 (BÄK)。

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